武汉天安医院

　　同种抗血小板抗体的检测方法之——ELISA法
　　1. ELISA法
　　1)试别和仪器
　　(1)一系列已知抗原表型的血小板，即PIA1/1，PIA2/2，Baka/a，Bakb/b，Yuka/a，Yukb/b，Bra/a， Brb/b，Siba/a等目前已知的血小板同种抗原纯合子(或杂合子)。
　　(2)已标记好的抗人IgG或IgM。
　　(3) 20%氯喹溶液：磷酸氯喹20g溶于PBS-EDTA(0.009mol/LEDTA，0.0264mo1/L磷酸氢二钠，0.14mol/L氯化钠)100mL中，pH5.0。
　　(4)酸性溶液：0.263mo1/L枸橼酸，0.123mo1/L磷酸氢二钠, pH3.0。
　　(5)血小板洗涤液：EDTA-PBS。
　　(6)枸橼酸缓冲液(pH6.5)。
　　(7)酶标仪。
　　2)操作方法
　　(1)处理血小板及包被：常规分离、洗涤血小板(包括一系列标准血小板及患者自身血小板)，去除血小板上HLA-I类抗原，有以下两种方法：①氯喹处理法：按1：4的比例加入氯喹溶液，4℃放置1小时；②用酸性溶液悬浮血小板，0℃放置10分钟，加人枸橼酸缓冲液中和。将处理好的血小板洗涤3次，计数后加入反应孔中，每孔50μL(血小板数为每孔106个)，离心10分钟(2500r/min)，每孔加入多聚甲醛50μL(终浓度1%)，10分钟后用PBS洗涤3次，晾干，干燥保存或每孔加入100μL的20%小牛血清-PBS封闭，冻存待用。
　　(2) ELISA检测：用0.05%Tween20/PBS洗涤已包被血小板的反应板2次，每孔加入待测血清50μL(1：50)，37℃孵育I小时，洗涤6次，每孔加入酶标抗人IgG或IgM50μ L，37℃孵育1小时，洗涤6次，每孔加人底物溶液100μL,37℃避光反应15-20分钟，加入25μL的终止液终止反应，在492nm波长下侧吸光光度值。
　　3)判断结果
　　每个反应板均设阴性及阳性对照孔，若检测孔吸光光度值与阴性孔吸光光度值之比大于1.5，则为阳性，阳性再根据组合情况判断出抗体相对应的同种抗原。