武汉天安中西医结合医院

【摘     要】

目的  探索干预或克服白血病细胞耐药的新策略。方法  采用抗CD₃McAb联合多种细胞因子诱导的脐血杀伤细胞（CB-CIK）体外作用于K₅₆₂耐药细胞株(K₅₆₂/A₀₂)，用MTT比色法检测其杀伤效应；用免疫组化染色法检测杀伤前后K₅₆₂/A₀₂细胞表面多药耐药基因mdr₁表达产物P₁₇₀水平；采用DNA凝胶电泳进行CB-CIK细胞诱导白血病细胞凋亡的检测。结果  ①CB-CIK细胞杀伤K₅₆₂/A02细胞活性（73.647±5.72）与杀伤K₅₆₂细胞活性（75.124±4.36）相比差异无统计学意义，P＞0.05；其杀瘤活性显著高于CB-LAK细胞、CB-CD₃AK细胞，P＜0.05，与成人CB-CIK细胞相比无显著性差异，P＞0.05。②经CIK细胞杀伤后，K₅₆₂/A₀₂细胞表面mdr₁表达产物P₁₇₀含量明显减少。③K₅₆₂/A₀₂细胞在CIK细胞作用20小时后，其DNA结构断裂，在DNA凝胶电泳上呈现凋亡特有的梯形图谱（DNA Ladder）。结论  CB-CIK细胞对K₅₆₂细胞及其耐药株K₅₆₂/A02细胞均有较强的杀伤作用，其杀伤机制可能与CIK细胞能下调白血病细胞表面多药耐药基因mdr₁表达产物P₁₇₀水平，以及诱导白血病细胞凋亡有关。提示脐血CIK细胞在抗白血病多药耐药性方面具有独特的优势，若与化疗联合使用，有可能成为克服白血病细胞多药耐药性的一种可供选择的新策略，因脐血的来源较广，采制相对简便，该研究方法可能具有广泛的应用前景。

 通讯作者 姚春 400-6325-120  传真号027-83661412

1、武汉天安中西医结合医院 血液病诊疗中心   武汉430050

2 华中科技大学同济医学院  内科（血液病专业）   武汉430022 

【关键词】 脐血CIK细胞，白血病 多药耐药性 凋亡

The Study of Tumor-Killing Effect on Drug-resistant Leukemia Cells by CIK Cells in the Cord Blood and Its Mechanism

*YAO chun. *Hematology department, the Fifth Hospita of Wuhan,    Wuhan 430050, china

        SONG shan-jun. Institute of Hematology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong university of Science and Technology, Wuhan 430022, china

【Abstract】

Objective To explore the new strategy for intervening and overcoming the multi-drug resistance (MDR) of leukemia cells.   Methods CD₃ monoclonal antibody (CD₃McAb) combined with multi-cytokines induced killer cells of the cord blood (CB-CIK) were used in killing drug-resistant leukemia cells(K₅₆₂/A₀₂) in vitro. The cytotoxic effects were detected by MTT assay. The level of P-glycoprotein (P₁₇₀ ) expression on surface of K₅₆₂/A₀₂cells tested by immuno-histochemical dyeing method. The apoptosis of K₅₆₂/A₀₂cells was measured by gel electrophoresis.   Results  There was no statistical difference between the cytotoxic effects of CB-CIK cells to K₅₆₂/A₀₂cells and that to K₅₆₂.cells.  Tumor-killing activities of CB-CIK cells to K₅₆₂/A₀₂cells  were significantly higher than that of CB-LAK cells and CB-CD₃AK cells, P＜0.05. But no significant difference in tumor-killing activities was found between CB-CIK group and PB-CIK group, P＞0.05. Killed by CB-CIK cells, the P₁₇₀ contents on surface of K₅₆₂/A₀₂ cells reduced obviously. After 20 hours co-culturing the CB-CIK cells and K₅₆₂/A₀₂ cells, apoptotic K₅₆₂/A₀₂ cells displayed clear DNA ladder band on DNA gel electrophoresis.Conclusion Tumor-killing activities of CB-CIK cells to K₅₆₂/A₀₂ cells were as efficient as that to K562.The efficient tumor-killing mechanism of CB-CIK cells may be CB-CIK cells reverse multi-drug resistance of leukemia cells and induce apoptosis of leukemia cells. So the method of CB-CIK cells combining with chemotherapy might be one of new strategy for overcoming MDR of leukemia cells.

【Kay words】 Leukemia,  multi-drug resistance (MDR), cord blood, CIK cell,  apoptosis

   目前化疗仍然是治疗白血病的重要手段之一。但是白血病细胞的多药耐药(multidrug resistance,MDR)是导致化疗失败，乃至造血干细胞移植后白血病复发主要原因。因此，探索干预或克服白血病细胞MDR的对策一直是临床研究的重点。我们采用抗CD₃单克隆抗体（CD₃McAb）联合多种细胞因子（INF-r、IL₂、IL₁、和IL₆等）诱导的脐血杀伤细胞（CB - CIK）体外杀伤耐药的白血病细胞，探讨其杀瘤机制。现报告如下。  

材料和方法                                  

1. CB-CIK前体细胞来源   脐血来自足月胎儿断脐后取血。成人外周血来自健康献血员。                                                                                                         

    2. 白血病细胞系   K₅₆₂及其耐药株由武汉大学生物保藏中心提供。K₅₆₂ 由本室常规传代。K₅₆₂/A02（耐阿霉素）在含1ug/ml阿霉素的RPMI 1640培养液培养。实验前一周在无阿霉素培养液中培养。                                                                      

    3.主要试剂  抗CD₃McAb系武汉生物制品所研制；IL₂为沈阳三生公司产品；IFN-r、IL₁和IL₆购自北京邦定生物公司。                                                      

    4. CB-CIK细胞的制备   取脐血5 ml，肝素抗凝，常规分离单个核细胞，用含人AB型血淸的RPMI 1640 培养液调整细胞浓度至1×10⁵，加入IFN-r 100 u/ml刺激淋巴细胞24小时后，再加入抗CD₃McAb 30ng/ml，IL₂ 1000u/ml，IL₁ 100 u/ml，IL₆100 u/ml，将培养体系置37℃、5 %CO₂ 条件下培养，每2～3 天换液一次。                                                                        

同时设对照组：CB-LAK组、CB-CD₃AK组和成人外周血PB-CIK 组。                                                                 

5. CB-CIK细胞体外杀伤白血病细胞活性测定   采用MTT比色法，具体操作如下：CB-CIK细胞及其它各组效应细胞分别与K₅₆₂、K₅₆₂/A₀₂按效：靶为50 ：1的比例，各取100ul接种于96孔培养板共同培养，并分别设效应细胞、靶细胞及培养液对照。将上述接种好的培养板置37℃、5%CO₂培养条件下温育20小时后，每孔加入MTT试剂50ul孵育4小时，再加入100ul酸化异丙醇，充分溶解后，用酶联仪570nm测定每孔吸光度A，根据公式计算杀伤率。

6. CB-CIK细胞体外诱导白血病细胞凋亡的检测   采用DNA凝胶电泳。将CB-CIK细胞与K₅₆₂/A02细胞混合体系（E：T=50：1）置37℃、5 % CO₂ 条件下温育20小时后，经Ficoll-Hypaque密度梯离心，分别收集试管底部（完整细胞）和上清部分（破碎的细胞）靶细胞成分，两者混合后，用PBS洗涤2次，再按标准的酚、氯仿、异戊醇抽提法进行DNA抽提。将抽提出的DNA样品10ug与加样缓冲剂TBE混合后，在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。DNA分子量标记物为λHindⅢ。泳动后经溴化乙锭染色，与紫外线下观察并摄片。                        

7. CB-CIK 细胞体外逆转白血病细胞多药耐药性测定    收集CB-CIK细胞处理后的K₅₆₂/A02细胞的方法同前，然后采用免疫组化法进行白血病细胞（K₅₆₂/A02）表面多药耐药基因（mdr₁）表达产物（P₁₇₀）测定。所用试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，其具体方法参照试剂盒说明操作。                                                   

结果观察：细胞膜及细胞浆有棕黄色着染者为P₁₇₀阳性细胞，否则为阴性。                                                                

8. CB-CIK细胞免疫标志测定   采用单克隆抗体间接免疫荧光法检测诱导前后CB-CIK细胞表面CD抗原变化。所用的试剂盒由武汉生物制品所提供，具体方法参照其说明书进行操作。                                                             

9. CB-CIK细胞分泌细胞因子能力的测定    CB-CIK细胞培养上清液中细胞因子TNF-a含量测定，采用酶联免疫法（ELISA）。所用试剂盒由北京邦定生物医学公司提供，具体方法参照试剂盒说明书进行操作。                                                                    

结    果                               

1. CB-CIK细胞杀伤耐药白血病细胞活性   结果显示CB-CIK细胞对K₅₆₂细胞及其耐药株K₅₆₂/A02细胞均有较强的杀伤作用，其杀瘤活性显著高于用同等量诱生剂诱导的CB-LAK细胞、CB-CD₃AK细胞，P＜0.05，与成人PB-CIK细胞相比无显著性差异，P＞0.05。CB-CIK细胞对K₅₆₂细胞敏感株和耐药株K₅₆₂/A02杀伤率的差异无统计学意义，P＞0.05，见表1、图₁。                                                               

2. CB-CIK细胞诱导耐药白血病细胞凋亡检测结果   经CB-CIK细胞作用20 小时后，耐药白血病细胞K₅₆₂/A02的DNA结构断裂，在DNA凝胶电泳上显示出清晰的梯状带（DNA Ladder）。与CB-LAK细胞和CB-CD₃AK细胞处理组相比较，脐血CIK细胞处理组的耐药白血病细胞K₅₆₂/A02的DNA Ladder明显，见图₂。                                                                     

3. CB-CIK细胞体外逆转耐药白血病细胞MDR测定结果     经CB-CIK 细胞作用20小时后，K₅₆₂/A02细胞表面多药耐药基因（mdr₁）表达产物P₁₇₀的含量明显减少，见图_3－6。                                             

4. CB-CIK细胞分泌细胞因子能力测定结果   CB-CIK细胞培养上清液中的TNF-a显著高于CB-LAK组和CB-CD₃AK组，P＜0.05，与PB-CIK组相比差异无显著性，P＞0.05。见表1                            

5. CB-CIK细胞免疫表型标志测定结果    CB-CIK细胞表面CD₃⁺CD₅₆⁺、CD₃⁺CD₈⁺T细胞亚群及活化T细胞(CD₂₅⁺) 亚群显著高于LAK 组和CD₃AK 组(P<0.05)。见表₂。     

讨论                                     
    近几年国内外有研究［1、2］显示抗肿瘤效应细胞对耐药的白血病细胞具有一定的杀伤作用，但对其杀瘤机制的研究报道甚少。我们的研究结果显

示脐血CIK细胞不仅具有较强的杀伤白血病细胞敏感株（K562）活性，而且对白血病细胞耐药株（K562/A02）同样具有较强的杀伤活性，对两者的杀伤能力相

比无显著性差异 P＜0.05，与文献报道一致［2、3］。我们还对不同的抗肿瘤效应细胞杀瘤活性进行了比较，结果显示脐血CIK细胞杀伤白血病细胞耐药株（

K562/A02）活性强，显著高于用同等量诱生剂诱导的CB-CD3AK细胞及CB-LAK细胞，P＜0.05，与成人外周血CIK细胞的杀瘤活性相比无显著性差异 P＜0.05

。从免疫表型分析上看［4］，脐血CIK细胞高效的杀瘤活性可能与其所含的杀伤细胞亚群〔CD+3CD+8细胞、CD3+CD56+和活化T细胞（CD+25）〕比例较高有关

。我们的研究结果还显示脐血CIK细胞具有更强的分泌细胞因子的能力，其培养的上清液中所含的TNFα水平显著高于CB-LAK细胞和CD3AK细胞，P＜0.01，与

成人外周血CIK细胞相比无显著性差异 P＜0.05。提示脐血CIK细胞不仅可以直接杀伤耐药白血病细胞，还可以通过分泌内源性细胞因子如TNF、IL2、IL4、

IFN等增强其杀瘤活性。                                                                                                                    
    白血病的MDR的发生机制很复杂，其中多药耐药基因（mdr1）编码的多药耐药蛋白（P170）高表达是MDR的主要机制。P170是一种能量依赖性药泵，

定位在细胞膜上，能主动地把白血病细胞内多种化学结构不相关的亲脂性化疗药物泵出细胞外，造成细胞内化疗药物浓度下降，细胞毒作用减弱，导致白血

病细胞多药耐药（MDR）。因此逆转白血病细胞MDR关键之一是要降低或抑制P170的表达和功能。我们用脐血CIK细胞作用于白血病多药耐药株（K562/A02）20

小时后，发现脐血CIK细胞能下调K562/A02细胞表面多药耐药基因（mdr1）表达产物P170的水平，因而可以增加白血病耐药细胞对化疗药物的敏感性，提高化

疗疗效。
    近年来抗凋亡机制在白血病的MDR形成中的作用受到人们的广泛重视，研究发现难治性及复发性白血病的MDR的发生与白血病细胞凋亡受抑密切相关

。因此诱导白血病细胞凋亡也是逆转白血病MDR的一个新的治疗靶点。我们的研究结果显示经脐血CIK细胞作用20小时后，白血病细胞的DNA结构断裂，呈现凋

亡的特征性改变，在琼脂凝胶电泳上表现为特有的梯形图谱（DNA  ladder）。与CB-LAK细胞、CB-CD3AK细胞相比较，脐血CIK细胞具有更强的诱导耐药性白

血病细胞凋亡的作用。
    总之，CB-CIK细胞具有高效的杀伤耐药白血病细胞的作用，其杀伤机制可能与CIK细胞能下调白血病细胞表面多药耐药基因mdr1表达产物P170水平，

以及诱导白血病细胞凋亡有关。提示脐血CIK细胞在抗白血病多药耐药性方面具有独特的优势，若与化疗联合使用有可能成为克服白血病细胞多药耐药性的新

策略。  

参考文献                        
1.陈宝安，陈苏宁，李翠萍，等。  CD3AK细胞对耐药白血病细胞的体外杀伤作用。中华血液杂志，2002，23：209－210。
2.Schmidt-Wolf IGH, Lefterova P, Johnston V, et al.  Sensitivity of multidrug-resistant tumor cell line to immunologic effector cells. 

Cellular Immunol, 1996,169:85-89.
3.MargolinKA, WrightC, FormanSJ.  Autologous bone morrow purging by in situ IL-2 activation of endogenous killer cells.  Leukemia, 1997,

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4.朱秋娟，桥振华，姜波，等。脐血CIK细胞的体外扩增特性研究。肿瘤研究与临床，2005，17：324-326.